Buyclindamycin.ru

Современные методы лечения

Получение оцДНК- и РНК-аптамеров

Как было ранее отмечено, аптамерами могут быть одноцепочечные молекулы ДНК или РНК. В случае отбора оцДНК-аптамеров связавшиеся с мишенью молекулы ДНК амплифицируют методом ПЦР с использованием праймеров, комплементарных константным участкам комбинаторной библиотеки (рис. 2) Для получения обогащенной оцДНК-библиотеки цепи полученной дцДНК необходимо разделить. Для этого в одну из цепей дцДНК (чаще не в целевую) вводят какой-либо объемный заместитель: биотин или биотин-стрептавидиновый комплекс , флуоресцентный краситель или олигонуклеотид-олигоэтиленгликолевый кэп Положение целевой цепи в геле детектируют в УФ-свете , по флуоресценции красителя или, если в нее была введена радиоактивная метка, методом радиоавтографии Систему биотин-стрептавидин применяют для разделения цепей ДНК и в другом варианте. Биотинилированную по одной цепи дцДНК инкубируют со стрептавидином, иммобилизованном на каком-либо носителе, с последующей денатурацией и выделением целевой оцДНК промывкой Другим вариантом получения обогащенной оцДНК-библиотеки является введение в 5'-праймер, используемый для амплификации, модификаций, способствующих деградации измененной цепи в соответствующих условиях. Примерами могут служить введение уридина по 3'-концу праймера с последующим щелочным гидролизом модифицированной последовательности или введение по 5'-концу праймера фосфатной группы с дальнейшей обработкой экзонуклеазой фага λ, которая расщепляет фосфорилированную цепь ДНК Проведение асимметричной ПЦР с избытком концентрации праймера, отвечающего аптамерной последовательности оцДНК, тоже приводит к желаемому результату Полученная обогащенная оцДНК-библиотека участвует в следующем раунде отбора.

В случае получения РНК-аптамеров синтезированную комбинаторную ДНК-библиотеку переводят в дцДНК-форму с использованием фрагмента Кленова ДНК-полимеразы E.coli и 5'-праймера для амплификации. Полученную дцДНК транскрибируют с помощью Т7 РНК-полимеразы. Для этого 5'-праймер для амплификации должен содержать последовательность промотора Т7 РНК-полимеразы. Полученную РНК-библиотеку используют в первом раунде отбора. Для получения обогащенной РНК-библиотеки связавшиеся с мишенью молекулы РНК амплифицируют методом ОТ-ПЦР с использованием праймеров, комплементарных константным участкам комбинаторной библиотеки (рис. 2). ПЦР-продукт выделяют из реакционной смеси и используют в качестве матрицы в реакции транскрипции in vitro. Полученная обогащенная РНК-библиотека участвует в следующем раунде отбора

Каждый вид аптамеров - и ДНК, и РНК - имеет свои преимущества. ДНК-аптамеры в отличие от РНК-аптамеров более стабильны в биологических средах Однако РНК-аптамеры за счет 2'-OH группы способны образовывать большее количество разнообразных вторичных структур (п. 1.4.). Повышение стабильности РНК-аптамеров в биологических средах может быть достигнуто введением в олигонуклеотидную цепь соответствующих модификаций (п. 1.3.).