Buyclindamycin.ru

Современные методы лечения

Методики эксперимента

Твердофазный фосфитамидный синтез комбинаторной библиотеки олигодезоксирибонуклеотидов

Приготовление растворов мономеров

Качество коммерческих препаратов фосфитамидов, используемых в работе, проверяли методом ТСХ в системе этанол:хлористый метилен (5:95). Защищенные дезоксирибофосфитамиды перед работой сушили над Р2О5 при 2-4 мм рт. ст. в течение 1 ч. Количество мономеров рассчитывали, исходя из того, что на каждую стадию конденсации требуется 60 мкл 0.05 М раствора мономера. Для синтеза константных участков комбинаторной оцДНК-библиотеки растворы фосфитамидов готовили из расчета 0.05 г мономера на 1 мл абс. CH3CN. Для синтеза рандомизированного участка комбинаторной оцДНК-библиотеки смешивали все четыре фосфитамида в одном флаконе из расчета 0.05 г dА-CE, 0.045 г dC-CE, 0.059 г dG-CE и 0.042 г dТ-CE на 1 мл абс. CH3CN. К готовым растворам фосфитамидов добавляли молекулярные сита.

Синтез комбинаторной оцДНК-библиотеки

Синтез вели на синтезаторе ASM-800 (“Биоссет”, Россия) в масштабе 0.4 мкмоль (реактор на 50 мкл) твердофазным фосфитамидным методом согласно протоколу, приведенному в табл. 3.

Таблица 3. Протокол операций автоматического фосфитамидного синтеза олигодезоксирибонуклеотидов

№п/п

Операция

Реагент

Кол-во мкл /эквивалентов

Время, сек

1.

Промывка

CH3CN

280

11.6

2.

Промывка

CH2Cl2

270

9.0

3.

Детритилирование

3% DCA в CH2Cl2

325

120.0

4.

Промывка

CH3CN

270

10.8

5.

Промывка

CH3CN абс.

250

10.0

6.

Конденсация

0.05 М р-р мономера*, 0.25 M р-р этилтиотетразола в CH3CN абс.

50 / 12.5 50 / 31

250.0

7.

Промывка

CH3CN

60

1.2

8.

Кэпирование

CpB (16% N-MeIm в THF) CpA (Ac2O/2,6-лутидин/THF (1:1:8))

130 / 1268 100 / 525

24.2

9.

Промывка

CH3CN

30

31.8

10.

Окисление

0.02 М I2 в THF / Py / H2O (90:1:9)

160 / 13

66.0

11.

Повторить п. 1-10

12.

Конец синтеза Повторить п. 1-4

Перейти на страницу: 1 2 3 4 5 6