Buyclindamycin.ru

Современные методы лечения

Получение rhVEGF165 в эукариотической системе экспрессии

Как упоминалось ранее, нативная форма VEGF165 содержит сайт гликозилирования (Asn75) и является гомодимером за счёт образования двух межцепочечных дисульфидных мостиков. Поэтому для получения биологически активной формы рекомбинантного VEGF использовали в качестве продуцентов эукариотические системы экспрессии. Такие как клеточные линии насекомых и ооциты китайских хомячков. Lee Seong-Baek с соавторами была описана методика получения rhVEGF165 в ооцитах китайских хомячков (Lee Seong-Baek et al., 2008). Авторами была достигнута сверхпродукция целевого белка, составившая более 80 мг/л, и разработана методика выделения, включающая последовательные стадии хроматографической очистки. Выход белка после стадий очистки составил 48%.

Особенностью эукариотической экспрессии в отличии от прокариотической является то, что продуцируемый белок экскретируется в питательную среду, и не образует телец включения, таким образом, не требуется дальнейшая процедура экстракции с последующей ренатурацией. Таким образом, количество стадий до получения чистого белка сводится к минимуму. В приведённом обзоре (Lee Seong-Baek et al., 2008) стадия очистки была реализована в два этапа. Первым этапом хроматографической очистки была ионообменная хроматография на сорбенте HiTrap-SP (Amersham Biosciences). Фракции, содержащие rhVEGF165, были дочищены на колонке HiTrapHeparin HP (Amersham Biosciences). В результате чистота белка составила 96%.

Отличие рекомбинантного белка полученного из CHO, от клеток насекомых, заключалось в структуре олигосахаридов и степени гликозилирования, которые наблюдались на SDS-PAGE электрофорезе.

В статье (Geum Young Lee et al., 2006) была представлена методика получения rhVEGF165 в клетках насекомых. В них также как и в клетках млекопитающих осуществляются эффективное гликозилирование, димеризация за счёт образования межмолекулярных дисульфидных связей и секреция целевого белка в культуральная среду. В качестве клеток продуцентов авторы использовали клеточные линии Spodoptera frugiperda Sf21. Ген был получен из клеточной линии карциомы яичников и клонирован в бакуловирусную систему экспрессии. Экспрессия целевого белка составила 20 мг на литр среды. Полученный белок очищали от компонентов культивационной среды трёхступенчатой хроматографией. Первый шаг включал в себя аффинную хроматографию на гепарин сефарозе. Элюат, содержащий целевой белок был сконцентрирован на центриконом 30 кДа и нанесён на колонку заполненную катионообменой смолой Resource S (GE Healthcare). Элюцию осуществляли линейным градиентом раствора NaCl. Далее элюат был дочищен методом быстрой жидкостной хроматографии (FPLC) на обращено-фазовом сорбенте Resource RPC. На выходе было получено 3 мг с литра культуральной среды. Таким образом, общий выход стадии очистки составил 15%.