Buyclindamycin.ru

Современные методы лечения

Основные методы работы

Для приготовления буферных растворов и реакционных смесей использовали бидистиллированную воду или воду, очищенную с использованием системы очистки воды Simplicity System (Millipore, Ирландия), стерилизованную автоклавированием.

Для измерения оптической плотности растворов олигонуклеотидов использовали NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, США). Концентрации растворов рассчитывали, используя коэффициенты молярного поглощения олигонуклеотидов при 260 нм, вычисленные с учетом гипохромного эффекта по формуле :

ε = 2·( ε1,2 + ε2,3 + . . . + εn-1,n) - ε2 - ε3 - . . . - εn-1,

где εi - молярный коэффициент поглощения нуклеотида N,

εi-1,i - молярный коэффициент поглощения для пары нуклеотидов.

Значения молярных коэффициентов поглощения для 2'-F-рибонуклеотидов принимали равными соответствующим молярным коэффициентам поглощения для рибонуклеотидов. Массы полученных дцДНК-библиотеки и 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки определяли из соотношений 1 о.е. = 50 мкг и 1 о.е. = 40 мкг, соответственно

Аналитический денатурирующий гель-электрофорез проводили в 12%-ном или 15%-ном ПААГ толщиной 0.4 мм в условиях: акриламид:N,N'-метиленбисакриламид (30:1), 7 М мочевина, 50 мМ Трис-борат (pH 8.3), 0.1 мМ Na2EDTA, при напряжении 50 B/см. Для нанесения олигонуклеотидных образцов на гель использовали денатурирующий буфер (буфер А) следующего состава: 8 М мочевина, 0.025%-ный ксиленцианол FF и 0.025%-ный бромфеноловый синий. После проведения электрофореза гель окрашивали раствором красителя “Stains-All”, приготовленным из 50 мг красителя “Stains-All” и 100 мл смеси формамид:вода (1:1). Полученные гели сушили в течение 1.5-2 ч с использованием Gel Dryer FB GD45 (Fisher Biosciences, США).

Препаративный денатурирующий гель-электрофорез проводили в 12%-ном или 15%-ном ПААГ толщиной 0.8 мм или 0.4 мм в условиях: акриламид:N,N'-метиленбисакриламид (30:1), 7 М мочевина, 50 мМ Трис-борат (pH 8.3), 0.1 мМ Na2EDTA, при напряжении 50 B/см. Для нанесения олигонуклеотидных образцов на гель использовали буфер А. После проведения электрофореза гель помещали на пластину для ТСХ (DC-Alufolien Kieselgel 60 F254, Merck, Германия) и визуализировали олигонуклеотиды в УФ-свете.

Нативный гель-электрофорез проводили в 12%-ном или 15%-ном ПААГ толщиной 0.8 мм в следующих условиях: акриламид:N,N'-метиленбисакриламид (30:1), 50 мМ Трис-борат (pH 8.3), 0.1 мМ Na2EDTA, при напряжении 50 В/см. Для нанесения олигонуклеотидных образцов на гель использовали нативный буфер для нанесения (буфер В): 0.05%-ный ксиленцианол FF и 0.05%-ный бромфеноловый синий в 50%-ном глицерине. Визуализацию олигонуклеотидов проводили как описано выше.

Электрофорез вектора pUC18 проводили в 1%-ном агарозном геле толщиной ~4 мм с использованием камеры MiniSub Cell GT (BioRad, США) в следующих условиях: 1%-ная агароза, бромид этидия (0.5 мкг/мл), 25 мМ Трис-борат (pH 8.3), 0.05 мМ Na2EDTA, при напряжении 12 В/см. Для нанесения олигонуклеотидных образцов на гель использовали нативный буфер для нанесения (буфер B). После проведения электрофореза гель визуализировали в УФ-свете в системе гель-детекции “Gel imager 2” (ООО “Компания Хеликон”).