Buyclindamycin.ru

Современные методы лечения

Получение rhVEGF165 в прокариотической системе экспрессии

Биологическая активность VEGF165 не зависит от гликозилирования Asn 75 (D. Peretz et al., 1992) поэтому, стало возможным, использование прокариотической системы экспрессии для получения терапевтически активных форм.

Бактериальная система экспрессии легко масштабируема и даёт возможность получить VEGF менее дорогостоящим способом в более короткие сроки (F. Baneyx, 1999; Graumann and Premstaller, 2006; Swartz, 2001). В литературе были описаны способы получения растворимых форм VEGF165 и VEGF121 виде гибридного белка (Arora, 1999; Kim, 2007). Литературе имеются многочисленные публикации по получению VEGF165 в составе теле включений (Scrofani et al., 2000; Morera et al., 2006).

В статье (Shelly A. Pizarro et al., 2010) авторами описан способ получения рекомбинантного VEGF 165 в бактериальной системе экспрессии выход, которого составил 9 г с литра биомассы, что на мой взгляд вызывает сомнение. Представлена стратегия очистки, включающая три шага хроматографирования. Ферментация биомассы осуществлялась в режиме «фед-бетч», за счёт чего достигалась так называемая высокая клеточная плотность. Синтезированый белок образовывал тельца включения, поэтому после дезинтеграции бактериальных клеток было необходимо осуществить экстракцию белка из телец включения с последующим рефолдингом. Хроматорафическая стадия включала последовательное использование хроматографии смешанного режима на сорбенте Capto™ MMC, далее применяли катионообменную смолу SP Sepharose HP и окончательную доочистку целевого белка осуществляли на гидрофобном сорбенте PhenylSepharose™ 6 FastFlow. Общий выход после стадий экстракции, ренатурации и хроматографии составил около 30%.Liang Lee с соавторами описали методику экспрессии и очистки рекомбинантного VEGF 165 в бактериальных клетках E. сoli Tuner (DE3) pLacI (Novagen, Madison, WI) (I-Liang Lee et al., 2010). В качестве экспрессионного вектора авторами была использована pET-1. Целевой белок экспрессировался в виде телец включения. Поэтому, также как и в ранее описанной статье, перед авторами стояла задача солюбилизировать тельца и осуществить ренатурацию экстрагированного белок. Экстракцию белка из телец включения осуществляли буферным раствором содержащий 4 М мочевину. Полученный экстракт телец включения содержал денатурированную мономерную форму rhVEGF165. Ренантурацию белка осуществляли поэтапным разведением экстракта раствором 1 М L-аргенина содержащем небольшое количество окисленного глутатиона. После чего ренатурационную смесь разделяли на катионообменом сорбенте Mono S. Выход белка после описанной стадии составил 1 мг на литр бактериальной культуры.

рекомбинантный васкулярный эндотелиальный рост